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通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2^－·），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。


植物体中SOD可分为3种类型：即铜锌-SOD（CuZn-SOD）、锰-SOD（Mn-SOD）和铁-SOD（Fe-SOD）。低等植物以Fe-SOD和Mn-SOD为主，高等植物以CuZn-SOD为主，CuZn-SOD主要位于细胞质和叶绿体中，Mn-SOD主要位于线粒体中，Fe-SOD一般位于一些植物的叶绿体中。三者相加等于总SOD（T-SOD）。经样本前处理过的样本中Mn-SOD和Fe-SOD活力丧失，但CuZn-SOD活力不变。

• 快速简便：全程约50分钟，可测100例左右样本。
  
• 灵敏度高：IC50=0.05g/ml，是邻苯三酚法的18倍。
  
• 稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。
  
• 再现性好：变异系数CV=1.7%。
  
• 回收试验：X =103.3%。
  
• 受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。

编号	组分	规格	保存
试剂一	缓冲贮备液	10mL×1瓶	4℃保存1年
		（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）
	试剂一应用液的配制：用时每瓶加双蒸水稀释至100mL，4℃保存1年
试剂二	底物液	10mL×1瓶	4℃保存1年
试剂三	基质液	10mL×1瓶	4℃保存1年
试剂四	酶贮备液	350μL×2支	-20℃保存
	酶稀释液	10mL×1瓶	4℃保存1年
	酶应用液的配制：酶贮备液:酶稀释液＝1:14，现配现用，酶应用液4℃保存。
试剂五	粉剂	1支	4℃保存1年
	试剂五的配制：用时加70℃～80℃热双蒸水75mL溶解后备用，若加热过程中水分 蒸发减少，此时必须用双蒸水补充至75mL，配好后的试剂4℃冷藏避光保存1年
试剂六	粉剂	1支	4℃保存1年
	试剂六的配制：用时加双蒸水75mL溶解后备用，配好后4℃冷藏避光保存6个月
	显色应用液的配制：试剂五:试剂六:冰乙酸=3:3:2，4℃避光冷藏3个月。 [注]：冰乙酸，分析纯级，乙酸浓度≥99.5%
试剂七	CuZn-SOD提取甲液	12mL×1瓶	4℃避光密封保存1年
	CuZn-SOD提取乙液	12mL×1瓶	4℃避光密封保存1年
试剂八	匀浆介质	60mL×2瓶	4℃避光保存1年

• 分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为550nm）
  
• 恒温水浴箱或气浴箱（孵育温度为37℃）
  
• 台式离心机
  
• 漩涡混匀器
  
• 微量移液器
  
• 冰乙酸（AR级乙酸含量99%以上）

• 20%植物组织匀浆液的制备：准确称取植物组织（0.2～0.5g），按重量（g）:体积（ml）=1:4的比例，加入4倍体积的匀浆介质，剪碎，冰水浴条件下进行匀浆，制备成20%的匀浆液，3500转/分，离心10分钟，取上清液待测。
  
• T-SOD最佳取样量的摸索
  吸取20%匀浆上清液0.1mL，加入匀浆介质0.2mL（稀释倍数为3倍），混匀，分别取10μL、30μL、50μL按操作表进行预试验，以确定最佳取样量。
  百分抑制率计算公式：
  

  抑制率（%）＝	对照OD值－总SOD测定OD值	×100%
  	对照OD值

  
  最佳取样范围：百分抑制率在15～55%之间基本呈正比曲线关系。取百分抑制率在45%～50%的某一管取样量作为最佳取样量。
  最佳取样量的调整：若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分），则需将样品浓度稀释或减少取样量后再测试。若百分抑制率小于20%时，则需将样品量加大后测试。
  注：这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60%或小于10%，各个测定组的结果在t检验运行中常常无显著性差异。
  
• CuZn-SOD的提取：吸取与T-SOD浓度一致的匀浆上清（即20%匀浆上清）0.1mL加入试管，再加入CuZn-SOD提取甲液0.1mL以及CuZn-SOD提取乙液0.1mL （稀释倍数为2，CuZn-SOD提取乙液不参与稀释），漩涡混匀90秒，静置5分钟，3500转/分，离心10分钟，此时液体分为三层，上层为无色透亮液体（待测液体），中层为蛋白层，下层为无色透亮液体。取上层无色透亮液体按操作表进行操作（CuZn-SOD的提取液的最佳取样量与T-SOD待测液通过预试验得到的最佳取样量相同即a）
  
• 操作表：
  

  成分	对照管	总SOD测定管	CuZn-SOD测定管
  试剂一应用液(ml)	1.0	1.0	1.0
  匀浆介质(ml)	a
  TSOD待测液(ml)		a
  CuZnSOD测定提取液(ml)			a
  试剂二(ml)	0.1	0.1	0.1
  试剂三(ml)	0.1	0.1	0.1
  酶应用液(ml)	0.1	0.1	0.1
  用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟
  显色应用液(ml)	2	2	2

  
  混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，双蒸水调零，比色。
  
• 植物组织中SOD活力计算
  
  • 单位定义：
    每克植物组织在本反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。
    
  • 计算公式：
    

    T-SOD活力 (U/g组织湿重)	＝	对照OD值－总SOD测定OD值	÷50%×	反应总体积(mL)	×	样本前处理 稀释倍数(3倍)	÷	称取组织重量(g)
    		对照OD值		取样量(mL)				匀浆介质加入量(mL)

    
    
    

    CuZn-SOD活力 (U/g组织湿重)	＝	对照OD值－CuZn-SOD测定OD值	÷50%×	反应总体积(mL)	×	样本前处理 稀释倍数(2倍)	÷	称取组织重量(g)
    		对照OD值		取样量(mL)				匀浆介质加入量(mL)

    
    
  • 计算举例：
    准确称取白菜叶片0.25g，加入匀浆介质1mL，剪碎，冰水浴条件下机械匀浆，制备成20%的匀浆液，3500转/分，离心10分钟，取得上清液。再用匀浆介质4倍稀释成5%的浓度，分成两份，分别用于T-SOD与CuZn-SOD测定，按样本前处理要求分别对两份匀浆液进行处理，先取稀释后的T-SOD待测液0.01mL、0.03mL、0.05mL进行最佳取样量摸索试验，实验结果表明，当加样量为0.05mL(即最佳取样量a)时，抑制率为43.3%，则分别取T-SOD与CuZn-SOD各0.05mL，再按照操作表进行检测，测得T-SOD测定管吸光度值为0.274，CuZn-SOD测定管吸光度值为0.253，对照管吸光度值为0.482，则计算结果为：
    
    

    T-SOD活力 (U/g湿片)

    ＝

    对照OD值－总SOD测定OD值

    ÷50%×

    反应总体积(mL)

    ×

    样本前处理 稀释倍数(3倍)

    ÷

    称取组织重量(g)

    ×

    样本测试前 稀释倍数

    对照OD值

    取样量(mL)

    匀浆介质加入量(mL)

    ＝

    0.482－0.274

    ÷50%×

    3.35

    ×3÷

    0.25

    ×4

    0.482

    0.05

    1

    ＝

    2775.63U/g湿片

    
    
    

    CuZn-SOD活力 (U/g湿片)

    ＝

    对照OD值－CuZn-SOD测定OD值

    ÷50%×

    反应总体积(mL)

    ×

    样本前处理 稀释倍数(2倍)

    ÷

    称取组织重量(g)

    ×

    样本测试前 稀释倍数

    对照OD值

    取样量(mL)

    匀浆介质加入量(mL)

    ＝

    0.482－0.253

    ÷50%×

    3.35

    ×2÷

    0.25

    ×4

    0.482

    0.05

    1

    ＝

    2037.24U/g湿片

    
    注：本试剂盒亦可用酶标仪读数（可在反应完后取200μL置于96孔板上，酶标仪550nm处读数，计算时需将所测OD值减去空板OD值后代入公式）。

相关搜索：植物铜锌超氧化物歧化酶测试盒(比色法)，植物铜锌超氧化物歧化酶检测试剂盒，植物CuZn-SOD检测试剂盒，植物铜锌SOD检测试剂盒